Analisis data publik
Data tentang garis keturunan SARS-CoV-2 dan tanggal pengambilan sampel dari rangkaian yang tersedia di Chili diperoleh dari situs Consorcio Genomas CoV2 yang tersedia di https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. Data vaksinasi diperoleh dari data publik Kementerian Sains, Teknologi, Pengetahuan dan Inovasi yang tersedia di https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (Produk 83).
Uji infektivitas
Virus pseudotipe yang membawa protein lonjakan SARS-CoV-2 berbeda dibuat seperti yang kami jelaskan sebelumnya12. Secara singkat, pseudotipe SARS-CoV-1 berbasis HIV-2 diproduksi dalam sel HEK293T dengan mentransfeksi pNL4.3-ΔEnv-Luc bersama dengan vektor pengkodean Spike pCDNA-SARS-CoV-2 yang sesuai dalam rasio molar 1:1. Plasmid mengkode lonjakan yang dioptimalkan kodon yang kekurangan 19 asam amino terakhir dari ujung terminal-C (SΔ19) yang diketahui menghindari retensi di retikulum endoplasma12 diperoleh dengan sintesis gen atau mutagenesis terarah situs yang disesuaikan (GeneScript) dan berisi mutasi berikut: garis keturunan A (urutan referensi), garis keturunan B (D614G), garis keturunan B.1.1.7 (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), silsilah P.1 (L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I) dan silsilah C.37 (G75V, T76I, Δ 246- 252, L452Q, F490S, D614G, T859N). Setiap preparasi pseudotipe dibersihkan dengan sentrifugasi pada 3,000 rpm pada suhu kamar, diukur menggunakan Kit ELISA Quantikine HIV-1 Gag p24 (Sistem R&D), dialokasi dalam 50% serum janin sapi (Sigma-Aldrich) dan disimpan pada suhu -80 °C sampai menggunakan. Jumlah virus pseudotipe yang berbeda (sebagaimana ditentukan oleh kadar protein HIV-1 p24) digunakan untuk menginfeksi sel HEK-ACE2 dan 48 jam kemudian, aktivitas firefly luciferase diukur menggunakan Luciferase Assay Reagent (Promega) dalam Microplate Glomax 96 luminometer (Promega).
Uji netralisasi
Tes netralisasi virus palsu dilakukan pada dasarnya seperti yang kami jelaskan sebelumnya12. Secara singkat, pengenceran serial sampel plasma (1:4 hingga 1:8748) disiapkan dalam DMEM dengan 10% serum janin sapi dan diinkubasi dengan 5 ng p24 dari setiap virus pseudotipe selama 1 jam pada suhu 37 °C dan kemudian, 1×104 sel HEK-ACE2 ditambahkan ke setiap sumur. Sel HEK293T (tidak mengekspresikan ACE2) yang diinkubasi dengan virus pseudotipe (garis keturunan A) digunakan sebagai kontrol negatif. Sel dilisiskan 48 jam kemudian, dan aktivitas firefly luciferase diukur menggunakan Luciferase Assay Reagent (Promega) dalam Glomax 96 Microplate luminometer (Promega). Persentase netralisasi untuk setiap pengenceran dihitung dan ID50 setiap sampel dihitung menggunakan GraphPad Prism versi 9.0.1.
Analisis statistik
Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism versi 9.1.2. Perbandingan beberapa kelompok untuk menetralkan titer antibodi (NAbTs) terhadap panel virus pseudotipe SARS-CoV-2 serta perbandingan respons NAb berdasarkan jenis kelamin dan status asap dilakukan dengan menggunakan uji berpasangan Wilcoxon. Perubahan faktor dihitung sebagai selisih titer rata-rata geometrik pada ID50 dibandingkan dengan virus pseudotipe tipe liar. Analisis korelasi antara NAbTs dan usia atau BMI dilakukan dengan menggunakan uji Spearman. Uji perbandingan berganda ANOVA satu arah dan Tukey dilakukan untuk analisis statistik infektivitas. Nilai p ≤0.05 dianggap signifikan secara statistik.
Persetujuan etis
Protokol penelitian telah disetujui oleh Komite Etika Fakultas Kedokteran Universidad de Chile (Proyek N° 0361-2021 dan N° 096-2020) dan Clínica Santa Maria (Proyek N°132604-21). Semua donor menandatangani informed consent, dan sampel mereka dianonimkan.
Dampak lonjakan mutasi pada varian Lambda terhadap infektivitas dan respons antibodi penetralisir
Analisis terhadap 3695 sekuens dari Chili yang disimpan di GISAID per 24 Junith Tahun 2021 menunjukkan dominasi yang jelas dari varian SARS-CoV-2 Gamma dan Lambda selama trimester terakhir, yang secara keseluruhan mencakup 79% dari seluruh rangkaian.
Menariknya, periode ini ditandai dengan kampanye vaksinasi besar-besaran di mana 65.6% dari populasi target (individu berusia 18 tahun ke atas) telah menerima skema vaksinasi lengkap per tanggal 27 Juni.th 2021
Mengingat 78.2% orang yang diinokulasi dengan skema lengkap menerima vaksin virus CoronaVac yang tidak aktif dari Sinovac Biotech, kami berupaya menyelidiki dampak lonjakan mutasi yang ada pada varian Lambda terhadap kapasitas penetralan antibodi yang dihasilkan oleh vaksin ini.
Untuk melakukan hal ini, kami membuat virus pseudotipe SARS-CoV-1 berbasis HIV-2 yang membawa protein lonjakan dari garis keturunan referensi Wuhan-1 (tipe Liar; garis keturunan A), mutasi D614G (garis keturunan B), dan Alpha (garis keturunan B). .1.1.7), varian Gamma (garis keturunan P.1) dan Lambda (garis keturunan C.37).
Selama persiapan virus, kami secara konsisten mengamati bahwa sel yang terinfeksi virus pseudotipe yang membawa lonjakan Lambda menghasilkan nilai bioluminesensi yang jauh lebih tinggi jika dibandingkan dengan mutan D614G atau varian Alpha dan Gamma yang menunjukkan peningkatan infektivitas yang didorong oleh protein lonjakan Lambda.
Gambar 1.Infektivitas dimediasi oleh protein lonjakan yang berbeda.
(A) Representasi skema protein lonjakan SARS-CoV-2 dan varian yang digunakan dalam penelitian ini. Silsilah ditunjukkan dalam tanda kurung. RBD, domain pengikat reseptor, CM; ekor sitoplasma.
(B) Titrasi pseudotipe setiap garis keturunan menggunakan jumlah HIV-1 p24 yang setara. Aktivitas kunang-kunang luciferase diukur sebagai unit pendaran relatif (RLU) pada 48 jam pasca infeksi. Rata-rata dan SD dihitung dari percobaan rangkap tiga yang representatif.
Selanjutnya, kami menggunakan virus pseudotipe yang disebutkan di atas untuk melakukan uji netralisasi menggunakan 79 sampel plasma dari petugas kesehatan yang sehat dari Universidad de Chile dan Clínica Santa María di Santiago, Chile.
Kami mengecualikan 4 sampel karena kami tidak dapat menghitung titer ID50. Dari sampel yang dianalisis, 73% berhubungan dengan wanita, usia rata-rata 34 tahun (IQR 29 – 43) dan indeks body max (BMI) 25 (IQR 22.7 – 27). Sebanyak 20.5% peserta dinyatakan sebagai perokok aktif selama masa imunisasi berlangsung. Sampel diperoleh dalam median 95 hari (IQR 76 – 96) setelah dosis kedua vaksin CoronaVac
Kami mengamati bahwa netralisasi virus pseudotipe yang membawa protein lonjakan tipe liar menghasilkan pengenceran penghambatan 50% (ID50) rerata titer 191.46 (154.9 – 227.95, 95% CI,), sedangkan 153.92 (115.68 – 192.16, 95% CI), 124.73 (86.2 – 163.2, 95% CI), 104.57 (75.02 – 134.11, 95% CI ) dan 78.75 (49.8 – 107.6, 95% CI) untuk virus pseudotipe yang masing-masing membawa protein lonjakan dari mutan D614G atau varian Alpha, Gamma, dan Lambda.
Kami juga mengamati bahwa titer rata-rata geometrik ID50 titer menurun sebesar 3.05 kali lipat (2.57 – 3.61, 95% CI) untuk virus pseudotipe yang membawa lonjakan Lambda, 2.33 (1.95 – 2.80, 95% CI) untuk lonjakan Gamma, 2.03 (1.71 – 2.41, 95% CI) untuk spike Alpha dan 1.37 (1.20 – 1.55, 95% CI) untuk spike D614G jika dibandingkan dengan spike tipe Wild.
Tidak ada korelasi antara jenis kelamin, usia, indeks massa tubuh (BMI) atau status merokok dan titer antibodi penetralisir yang diamati dalam kelompok penelitian kami.
Gambar 2.Uji netralisasi menggunakan sampel plasma dari penerima vaksin CoronaVac
(A) Perubahan titer netralisasi timbal balik 50% (ID50) pada sampel plasma dari 75 penerima vaksin CoronaVac terhadap D614G (garis keturunan B), Alpha (garis keturunan B.1.1.7),
Varian Gamma (lineage P.1) dan Lambda (lineage C.37) dibandingkan dengan virus tipe liar. Hasil ditampilkan sebagai perbedaan titer netralisasi sampel yang cocok. Nilai P untuk perbandingan ID50 dihitung dengan uji peringkat bertanda Wilcoxon.
(B) Plot kotak menunjukkan median dan rentang interkuartil (IQR) ID50 untuk setiap virus pseudotipe. Perubahan faktor ditampilkan sebagai perbedaan titer rata-rata geometrik pada ID50 dibandingkan dengan virus pseudotipe tipe liar. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan uji peringkat bertanda pasangan berpasangan Wilcoxon.
Bersama-sama, data kami mengungkapkan bahwa protein lonjakan dari varian baru Lambda, yang banyak beredar di Chili dan negara-negara Amerika Selatan, membawa mutasi yang meningkatkan infektivitas dan kemampuan untuk melepaskan diri dari antibodi penawar yang dihasilkan oleh CoronaVac.
